A la fin des années 1980, au fur et à mesure de l'avancée des progrès, la microscopie confocale laser présente un défaut majeur : l'ouverture confocale bloque non seulement la fluorescence générée à l'extérieur du point focal, mais bloque également la fluorescence générée par le point focal qui est diffusée par les tissus biologiques, entraînant une diminution de l'efficacité de collecte de la fluorescence, et la profondeur d'imagerie ne peut pas être supérieure à 100 micromètres. Ainsi, dans les années 1990, la microscopie à fluorescence à deux photons combinant la microscopie confocale laser et la technologie d'excitation à deux photons a vu le jour. La longueur d'onde d'excitation du processus d'absorption à deux photons est généralement définie dans la plage de fenêtre bio-optique de 680-1080 nm, ce qui évite les dommages de la lumière ultraviolette aux cellules ou aux organismes vivants et pénètre plus profondément.
Actuellement, le microscope à fluorescence à deux photons le plus utilisé est le laser à pierres précieuses en titane femtoseconde, qui est volumineux et coûteux, ce qui limite l'application de la microscopie à fluorescence à deux photons dans divers domaines tels que les sciences de la vie, la chimie et la médecine. Ainsi, dans certains domaines tels que les diagnostics médicaux, les gens ont essayé d'utiliser des lasers à semi-conducteurs sub-nanosecondes compacts et abordables comme source de lumière standard.
Le principe de base de l'excitation à deux photons est que, lorsqu'une molécule fluorescente est excitée sous une densité de photons élevée, elle absorbe simultanément deux photons de grande longueur d'onde, puis renvoie spontanément des photons fluorescents à l'état fondamental après des sauts d'excitation et des processus de relaxation. Par rapport à la microscopie à fluorescence à excitation à photon unique conventionnelle, la génération de signal optique dans la microscopie à fluorescence à excitation à deux photons est non linéaire, la lumière d'excitation étant une source de lumière à plus longue longueur d'onde et à puissance de crête plus élevée, et les photons fluorescents émis ayant une longueur d'onde légèrement supérieure à la moitié de la longueur d'onde d'excitation.
La microscopie à fluorescence à deux photons utilise une source de lumière laser proche infrarouge et sa nature non linéaire ne nécessite pas d'ouverture confocale. Par conséquent, par rapport à la microscopie confocale, la microscopie à fluorescence à deux photons présente les avantages suivants :
- Grande profondeur d'imagerie et faibles dommages optiques ;
- Aucune ouverture confocale n'est requise et l'efficacité de la collecte de fluorescence est grandement améliorée.
- Résolution spatiale et contraste supérieurs ;
- Petite plage d'excitation, petite phototoxicité et blanchiment ;
- Les longueurs d'onde d'émission et d'excitation sont éloignées, évitant le chevauchement spectral;
